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体彩6场半全场胜负结果:非編碼RNA

非編碼RNA(Non-coding RNA)是指不編碼蛋白質的RNA。其中包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA 、microRNA 和lncRNA等多種已知功能的 RNA,還包括未知功能的RNA。

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一類長度>200bp的RNA,由RNA聚合酶Ⅱ轉錄,lncRNA具有保守的二級結構,大部分不編碼蛋白質。LncRNA發揮功能的方式很廣,可以與蛋白、DNA和RNA相互作用,參與多種生物學過程的調控。主要包括基因組表觀遺傳修飾、調控轉錄后翻譯、發揮ceRNA、增強子RNA作用等,從而對細胞的增殖、分化、遷移、凋亡、免疫等發揮調控作用。

金開瑞提供的非編碼RNA服務:miRNA、lncRNA、tRFs

研究方案(以lncRNA為例)

1、采用二代測序或芯片技術找出不同組樣本差異表達的lncRNA

圖1. LncRNA 差異表達聚類結果及差異表達火山圖

2、lncRNA/miRNA篩選驗證

采用RT-PCR或者qRT-PCR檢測lncRNA/miRNA在不同組織和細胞中的表達水平。

圖2. PVT1和 miRNA在宮頸癌組織中的表達

(Iden, M.et al.The lncRNA PVT1 Contributes to the Cervical Cancer Phenotype and Associates with Poor Patient Prognosis.PloS one.2016.May 27;11(5))

3、細胞系鑒定

采用對肝癌細胞(如hepG2、hep3b、huh7)STR位點和Amelogenin位點的基因分型技術,進行細胞鑒定。

Marker 細胞庫信息
Allele1 Allele2 Allele3 Allele1 Allele2 Allele3
D5s818 13 13 13 13
D13s317 10 11 12 14
D7s820 10 11 12 14
D16s539 10 10 10 10
VWA 16 18 17 17
TH01 7 7 6 7
AMEL X X X X
TPOX 8 11 9 9
CSF1PO 11 11 8 8
D21S11 30 30

4、lncRNA功能及下游靶標分子研究

4.1、構建lncRNA/miRNA的過表達(基因敲除)穩轉癌細胞株;

圖3. 基因過表達/敲除后單克隆細胞株的篩選

圖4. CRISPR/Cas9和慢病毒穩定細胞系

4.2、MTT/CCK8法測定細胞生長活力;

圖5. 轉染TP53TG1 減少了細胞的活力

(Diaz-Lagares A, et al.Epigenetic inactivation of the p53-induced long noncoding RNA TP53 target 1 in human cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Nov 22;113(47):E7535-E7544.)

4.3、流式細胞檢測細胞凋亡;

圖6. HCT-116 cells 穩定轉染TP53TG1 24小時后檢測細胞的凋亡率

(Diaz-Lagares A, et al.Epigenetic inactivation of the p53-induced long noncoding RNA TP53 target 1 in human cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Nov 22;113(47):E7535-E7544.)

4.4、軟瓊脂克隆形成實驗;

圖7. TP53TG1 抑制了HCT-116細胞的克隆形成

(Diaz-Lagares A, et al.Epigenetic inactivation of the p53-induced long noncoding RNA TP53 target 1 in human cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Nov 22;113(47):E7535-E7544.)

4.5、細胞劃痕實驗;

圖8. 傷痕愈合實驗檢測 VIM 敲低和過表達對細胞侵襲力的影響

(Peng Zheng,Quantitative Proteomics Analysis Reveals Novel Insights into Mechanisms of Action of Long Non-coding RNA HOTAIR in Hela Cells.MCP. 2015.)

4.6、細胞體外Matrigel侵襲實驗;

圖9. 與siCONT細胞相比,siPVT1細胞侵襲力明顯降低

(Iden, M.et al.The lncRNA PVT1 Contributes to the Cervical Cancer Phenotype and Associates with Poor Patient Prognosis.PloS one.2016.May 27;11(5))

4.7、Western blot檢測腫瘤相關蛋白表達。

圖10. 用不同濃度的EW-7197 (0.25, 0.5, 1.25 and 2.5 μM) 處理A549-CUG2 and BEAS-CUG2 細胞24 h。免疫印跡檢測 CUG2, E-cadherin, N-cadherin, and vimentin 的表達

(Kaowinn S, Kim J, Lee J, Shin DH, et, al. Cancer upregulated gene 2 induces epithelial-mesenchymal transition of human lung cancer cells via TGF-β signaling. Oncotarget. 2016 Dec

5、蛋白質組學尋找調控的下游靶標分子

應用蛋白質組學iTRAQ(SILAC,SWATH)定量方法和生物信息學找到lncRNA/miRNA調控的靶標。

圖11. 蛋白質組學ITRAQ/SWATH 和差異蛋白通路分析

6、采用FISH技術研究lncRNA在細胞中定位分布

圖12. 目的lncRNA在細胞中的位置分布(18S和U6為內參)

7、lncRNA作用機制研究

7.1、采用體外轉錄技術,RNA pull down, LC- MS等技術手段檢測與RNA互作的蛋白質。

圖13. RNA pull down后質譜鑒定、WB檢測

7.2、RIP驗證與蛋白質結合的lncRNA或者lncRNA與miRNA的互作

圖14. AP-1蛋白與RNA的相互作用RIP

圖15. MS2- RIP實驗原理圖(表達Lnc-A的質粒富集miRNA1miRNA2的效率比不表達Lnc-A的MS2組明顯提高。通過對照,說明MS2-A可以與miRNA1和miRNA2相互結合)

7.3、雙熒光素酶基因檢測miRNA和lncRNA/mRNA的互作情況

生物信息學預測分析

圖16. 利用生物信息學方法預測lncRNA與miRNA的結合位點

雙熒光素酶和RIP驗證

圖17. 雙熒光素酶和RIP驗證lncRNA可以與miR-26a結合

(C Cao, Zhang T, Zhang D, et al.The long non-coding RNA, SNHG6-003, functions as a competing endogenous RNA to promote the progression of hepatocellular carcinoma. Oncogene. 2017 Feb 23;36(8):1112-1122. )

8、動物實驗

8.1、成瘤模型

圖18. 肝癌裸鼠成瘤模型,通過活體成像和測量觀察不同處理小鼠腫瘤的生長、轉移情況

(C Cao, Zhang T, Zhang D, et al.The long non-coding RNA, SNHG6-003, functions as a competing endogenous RNA to promote the progression of hepatocellular carcinoma. Oncogene. 2017 Feb 23;36(8):1112-1122. )

8.2、普通藥物模型或基因治療模型

8.3、模式動物:CRISPR/Cas9敲除或敲入的模式動物

圖19. 腺病毒注射小鼠尾靜脈后,隔一段時間通過肺組織切片觀察某基因對肺的影響

8.4、損傷修復模型

如骨斷裂恢復模型

圖20. 小鼠骨斷裂后用SEC2處理,X-ray拍攝結果顯示SEC2組小鼠恢復更快

(Xu J, Wu T, Sun Y, et al.Staphylococcal Enterotoxin C2 Expedites Bone Consolidation in Distraction Osteogenesis. J Orthop Res. 2017 Jun;35(6):1215-1225. )

參考文獻

1、Budhu A, Forgues M, Ye QH, et al. Prediction of venous metastases, recurrence, and prognosis in hepatocellular carcinoma based on a unique immune response signature of the liver microenvironment. Cancer Cell. 2006 Aug;10(2):99-111.

2、Fidler IJ. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat Rev Cancer. 2003 Jun;3(6):453-8.

3、Oca?a OH, Córcoles R, Fabra A, et al. Metastatic colonization requires the repression of the epithelial-mesenchymal transition inducer Prrx1. Cancer Cell. 2012 Dec 11;22(6):709-24.

4、Massagué J. TGFbeta in Cancer. Cell. 2008 Jul 25;134(2):215-30.

5、Faghihi MA, Modarresi F, Khalil AM, et al. Expression of a noncoding RNA is elevated in Alzheimer's disease and drives rapid feed-forward regulation of beta-secretase. Nat Med. 2008 Jul;14(7):723-30.