???? 常見問題與解答
酵母雙雜交技術常見問題與解答
文章來源:genecreate 作者:genecreate 發布時間:2017-12-29 15:57
1.Q: 酵母雙雜交的篩選流程?
A: 將已知基因作為誘餌,在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白,從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到AD-LIBRARY質粒,對質粒中的cDNA片段進行測序,并對該片段的編碼序列在GENEBANK中進行比較,研究與已知基因在生物學功能上的聯系。
 
2. Q: 酵母雜交技術有哪些優勢?
A: a.體內的互作驗證,省去蛋白表達、純化等步驟;b. 細胞內驗證,在一定程度上反應細胞內的真實情況;c. 可以檢測微弱的蛋白互作;d. 可對不同組織、器官、細胞、分化階段材料進行文庫構建和篩選
 
3.Q:如何確定是選擇構建核體系文庫還是膜體系文庫?
A: 如果誘餌基因是定位在膜上的蛋白則選擇膜體系文庫,如果誘餌基因是定位于核則選擇核體系文庫,如果誘餌基因有跨膜區也可以考慮把跨膜區切除以后用核體系文庫篩庫,但是這樣操作有一定風險。
 
4.Q: 如果誘餌蛋白能夠直接激活報告基因的表達,改如何處理?
A: 該蛋白很可能是轉錄因子,具有轉錄激活域??梢醞ü蛑刈榍械糇技せ鈑?,然后重新檢測其是否自激活。但是要注意重組也有可能破壞蛋白之間的互作。
 
5.Q: 雜交效率不高,怎么辦?
A: 在雜交中,預轉化的誘餌細胞的數量可能不夠。當對誘餌菌株進行液體培養過夜時,應挑選大的、新鮮的克隆進行培養,經過離心和重懸后,再使用血球計對細胞進行計數,提高雜交效率。
 
6.Q: 酵母雙雜交出現假陽性的原因?如何解決?
A:由于BD融合誘餌蛋白有單獨激活作用,或者其激活作用被外來蛋白激活。AD融合靶蛋白如果有DNA的特異性結合,則也可單獨激活報告基因的表達。因此,需要作嚴格的對照試驗,對誘餌和靶蛋白分別作單獨激活報告基因的鑒定,以排除假陽性。也可以采用多個報告基因,且每個報告基因的上游調控區各不相同,這可減少大量的假陽性。另外,報告基因整合到染色體上,可以使基因表達水平穩定,消除了由于質??獎詞浠鴰蟣澩鎪講ǘ斐傻募傺糶?。
 
7.Q: 酵母雙雜交系統有哪些應用?
A: a.發現新的蛋白質和蛋白質的新功能;b. 在細胞體內研究抗原和抗體的相互作用;c. 篩選藥物的作用位點;d. 建立基因組蛋白連鎖圖
 
8. Q: 金開瑞酵母雙雜交有哪些優勢?
A: a.我們會進行自激活及毒性檢測;b. 文庫構建,我們采用純化分離mRNA材料建庫,增加了文庫樣本的有效性,5’端引物設計保證N端序列的有效性;c. 文庫容量達標(>1*107cfu/mL)

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